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細(xì)胞學(xué)堂 | 一文了解細(xì)胞爬片制作全過(guò)程

更新時(shí)間:2024-04-17  |  點(diǎn)擊率:811


圖片

細(xì)胞爬片是一種將細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃或塑料表面上,使其附著并擴(kuò)展的技術(shù)。一般是讓玻片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),使細(xì)胞在玻片上生長(zhǎng)。這種技術(shù)可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用等。利用細(xì)胞爬片進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)可排除體內(nèi)諸多干擾因素的影響,方便對(duì)細(xì)胞進(jìn)行各種干預(yù)處理。


我們?cè)谧雒庖邿晒猓↖F)、原位雜交(FISH)、凋亡檢測(cè)(TUNEL)等實(shí)驗(yàn)時(shí),都需要制備細(xì)胞爬片,而爬片質(zhì)量會(huì)影響到最后的圖片呈現(xiàn)效果以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了細(xì)胞爬片的制作步驟及注意事項(xiàng),幫助您快速上手開展實(shí)驗(yàn)。





操作步驟


01

爬片準(zhǔn)備

1

根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇合適大小的爬片。

2

爬片處理,首先浸酸:5%稀鹽酸浸泡過(guò)夜(最好逐片浸入,多片同時(shí)浸入會(huì)引起多片粘連、浸洗不充分),第二天先用自來(lái)水沖洗20次,再用三蒸水沖洗2次(清除殘留酸液)

3

將爬片置于無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜(浸洗脂類污漬),75%乙醇長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?span style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgba(78, 77, 77, 0.69);">(無(wú)需高壓滅菌)。使用時(shí)鑷子取出爬片,酒精燈烘烤,放入孔板。


02

細(xì)胞爬片

1

收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),按照實(shí)驗(yàn)需求用完-全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至合適濃度。

2

加細(xì)胞前,先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴加少量培養(yǎng)基(目的是使爬片與培養(yǎng)皿靠液體的張力粘合到一起),然后輕放爬片(注意不要產(chǎn)生氣泡,防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起)整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。

3

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求接種合適細(xì)胞量到培養(yǎng)器皿內(nèi)。


03

爬片的固定

固定液的選擇:

1)多聚甲醛(常用4%)

可用于免疫電鏡、免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。室溫固定15~30 min后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。


2)4%中性甲醛:

又名“10%中性福爾馬林",應(yīng)用廣泛,常用于免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好,且穿透性強(qiáng),但甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色;分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完-全掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露,可能造成假陰性的染色結(jié)果。室溫固定15~30 min后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。


3)其他

如冷丙酮、75%~95%乙醇等,具體的以實(shí)驗(yàn)要求為準(zhǔn)。


以多聚甲醛為例進(jìn)行固定:

1

準(zhǔn)備4%多聚甲醛(PFA),于4℃冰箱中保存,使用時(shí)常溫復(fù)溫。

2

在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次,每次3 min,輕輕晃動(dòng),避免將細(xì)胞沖掉。

3

用4%的多聚甲醛固定爬片15 min(細(xì)胞自帶熒光時(shí)注意避光),PBS浸洗爬片3次,每次3 min

4

Triton X-100(PBS配制,濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整)室溫通透20 min

5

PBS浸洗爬片3次,每次3 min

6

按實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。




04

細(xì)胞爬片封片

封片前根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求決定是否需要孵育抗體或復(fù)染核。孵育好后用PBS浸洗3次,用吸水紙吸干爬片上的液體,封片液封片。






注意事項(xiàng)

固定好的細(xì)胞爬片建議盡快用于實(shí)驗(yàn),以免影響實(shí)驗(yàn)效果。

取爬片時(shí)注意控制力度,夾取時(shí)盡量夾取爬片邊緣,以免夾破爬片或造成劃痕。

細(xì)胞爬片取出后,一般用PBS潤(rùn)洗3遍(潤(rùn)洗操作盡量輕柔,以免細(xì)胞脫壁;根據(jù)研究目的,可調(diào)整潤(rùn)洗次數(shù),避免細(xì)胞脫壁),然后做固定。

對(duì)于貼壁性較差的細(xì)胞,可提前用包被液(明膠,多聚賴氨酸,鼠尾膠原等)包被爬片。

如果細(xì)胞帶有熒光標(biāo)記,所有操作步驟盡量在較暗處進(jìn)行。

常見孔板細(xì)胞爬片(圓形)大小參考:

爬片尺寸

配套孔板

直徑12 mm,厚度0.13~0.17 mm

24孔板

直徑18 mm,厚度0.13~0.17 mm

12孔板

直徑22 mm,厚度0.13~0.17 mm

6孔板







注:各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的操作流程都各有差異。此方案是我們實(shí)踐驗(yàn)證可行的方案。




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